No conocemos muchos datos acerca de su vida. Sabemos que se casó dos veces: la primera vez con una bailarina llamada Mariana, que trabajó al servicio del Duque de Medinaceli (y de quien se ha sugerido que pudo ser amante); y la segunda con la valenciana Ángela Rafaela Trilles, con la que tuvo una hija. En un principio trabajó como batihoja, pero posteriormente se consagró íntegramente al teatro, siendo no sólo dramaturgo, sino también actor y director. Según Diago (1990: 46-47), su actividad teatral que se conoce con certeza cubriría un lapso de tiempo de veinticinco años: desde 1540 hasta 1565, fecha en la que murió en Córdoba:
- en 1542 y 1543 participa en el Corpus Christi de Sevilla.
- en 1551 se encuentra en Valladolid para celebrar el recibimiento del príncipe Felipe en su vuelta de Flandes.
- entre 1546 y 1551 está al servicio de Pedro de Montiel, hilador de seda y compañero de Rueda.
- en 1554 se encuentra en casa del conde de Benavente, para organizar una despedida a Felipe II, que se marchaba a Inglaterra.
- en 1558 representa una comedia en la catedral de Segovia y se plantea construir un teatro permanente en Valladolid (no olvidemos que este hecho constituía una novedad).
- en 1559 participa de nuevo en el Corpus de Sevilla con dos obras, de las cuales el Auto de Navalcarmelo merecerá el premio del municipio.
- en 1560 permanece un tiempo en Valencia, no se sabe cuánto, aunque supondrá una parte importante de su vida. Allí contrae matrimonio en segundas nupcias con la citada Ángela Rafaela y es allí donde presumiblemente conoce a su futuro editor (Timoneda)
- en 1561 pasa por Madrid y por Toledo y actúa ante la reina.
- en 1563 participa en el Corpus de Toledo, ciudad en la que también bautiza a su hija.
- de 1565 es el testamento que hace en Córdoba, mediante el cual sabemos que Juan de Figueroa, sobrino y editor de Diego Sánchez de Badajoz, le debía una cierta cantidad de dinero, ya que había sido representada en casa de éste una farsa durante doce días.
Acerca de si tuvo una verdadera compañía o no, no se puede establecer con certeza. Indica Diago (1990: 48-49) que ciertos críticos establecen que ésta se redujo al propio Rueda y a su mujer Mariana, «a los que se uniría en 1554 Pedro de Montiel», pero añade que aunque esto fuera cierto, existe la posibilidad de que los cómicos fueran también «reclutados sobre la marcha en el mismo lugar de la representación».
